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實驗技術交流

原核表達原理、步驟、載體構建、常見問題分析

文字:[大][中][小] 手機頁麵二維碼 2019/2/26     瀏覽次數:    

本文從原核表達的原理講起,再結合具體實例,給大家介紹了原核表達步驟、載體構建以及常見的一些問題並給出了相關的解決方案,便於初學者能夠快速了解掌握原核表達。

在基因工程領域,常說的原核表達是指通過基因克隆技術,將外源目的基因克隆到原核質粒並導入表達宿主菌進行誘導表達的過程。在原核蛋白表達體係中,最常用的就是大腸杆菌表達係統,外源基因通常需要誘導劑的誘導才能進行表達,常用誘導劑 IPTG,乳糖等誘導方式,其中IPTG是最常用的誘導方式,以IPTG誘導原核表達為例:


IPTG誘導原核表達原理

IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)在沒有乳糖存在時,lac操縱子處於阻遏狀態。此時,I序列在PI啟動序列操縱下表達的Lac阻遏蛋白與O序列結合,阻礙RNA聚合酶與P序列結合,抑製轉錄啟動。當有乳糖存在時,lac操縱子即可被誘導。在這個操縱子體係中,真正的誘導劑並非乳糖本身。乳糖進入細胞,經β-半乳糖苷酶催化,轉變為異乳糖。後者作為一種誘導劑分子結合阻遏蛋白,使蛋白構象變化,導致阻遏蛋白與O序列解離、發生轉錄。異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的作用與異乳糖相同,因此兩者均可以作為原核表達的誘導劑。IPTG在作為誘導劑參與原核表達的進程,單其本身並不被消耗,隻是化學反應的一個中間物質。


原核表達的組成原件

完整的原核表達係統通常包括表達質粒,宿主菌株,誘導劑,純化或檢測標記等原件。

選擇表達係統通常要根據實驗目的來考慮,比如表達產物形式,目標蛋白的活性,產物的純化工藝等。


原核表達的優缺點

優點 缺點
宿主菌生長快,能夠在較短時間內獲得基因表達產物
通常使用的表達係統無法對表達時間及表達水平進行調控
所需試劑耗材成本低廉
有些基因的持續表達可能會對宿主細胞產生毒害作用
培養簡單,操作方便
過量表達可能導致非生理反應,目的蛋白常以包涵體形式表達,導致產物活性喪失
遺傳背景清楚,基因安全
原核表達係統翻譯後加工修飾體係不完善,表達產物的生物活性較低
蛋白表達量高


原核表達步驟過程

一、目的片段的獲取

1.1引物設計

以下內容以豬HKX基因為例進行闡述

在NCBI上查找到的目基因mRNA CDS區序列(1490 bp),使用Primer Premier 5.0軟件進行引物的設計,在設計引物時,上下遊引物的5’段均引入合適的酶切位點和保護性堿基。


1.2 PCR擴增

PCR Taq MIX 25 μL
上遊引物
1 μL
下遊引物
1 μL
模板
X μL200~500 ng)
dd H2O
to 50 μL


PCR 反應條件
PCR
98 ℃ 5 min 預變性
98 ℃
10 sec
30 Cycles
55 ℃
30 sec
72 ℃
1 min/kb
72 ℃
5 min


1.3瓊脂糖凝膠電泳膠回收PCR目的片段

根據目的條帶大小配置相應濃度的瓊脂糖凝膠,微波爐加熱完全溶解後,冷卻至60℃左右,按照1:20000加入4S green染料,混勻後倒入凝膠鑄槽中,插入梳子,除去氣泡,待完全凝固後拔出梳子。

將凝膠置於電泳槽中,加樣孔放置於負極,進行加樣(選取合適的DNA Marker)。100V,100 mA電泳40 min,根據DNA Marker指示條帶在凝膠上的位置決定電泳是否終止。然後將凝膠放置在凝膠成像儀中切膠回收。


二、表達載體的準備

不同的表達載體具有不同的優勢,在分析基因序列之後可以選擇最佳的表達係統進行重組表達質粒構建。因科研需求,需要pET係列、pGEX係列、pCold I~IV、pCold(BL21分子伴侶)係列等原核表達載體,亦可選擇的實物外包服務:原核表達


2.1表達質粒準備

例:接種轉化有pCold I的DH5α菌種,按照1:100接種到4mL LB中,加入氨苄青黴素(終濃度50 μg/mL),37 ℃ 220 rpm培養過夜,提取新鮮質粒。


2.2載體及PCR產物雙酶切

選擇合適的酶切位點,對目的片段和表達載體進行酶切反應。

例:


質粒DNA
膠回收PCR產物
10×Quick Cut   Buffer
5 μL
5 μL
DNA 
≤1 μg
≤0.4 ug
Quick Cut 酶1(EcoR I) 
1 μL
1 μL
Quick Cut 酶2(Xho I)    
1 μL
1 μL
滅菌水  
補至50 μL
補至50 μL

37 ℃消化15 min,之後進行膠回收。

HKX PCR電泳及pCold I載體酶切 - 合肥知恩生物

A:HKX PCR條帶約1500bp

B:pCold I載體雙酶切結果約4400bp


2.3連接反應

將膠回收得到的PCR產物和載體進行連接。

目的片段膠回收產物
3 μL
載體膠回收產物
7 μL
Solution I
10 μL
滅菌
to 20 μL

16 ℃連接2 h載體摩爾比例在10:1到3:1之間。


三、目的蛋白的表達

3.1連接產物轉化DH5α

使用合肥知恩生物技術有限的DH5α細胞來進行連接產物轉化。

a.從-80℃取出DH5α感受態細胞,放在冰上融化;

b.將10 μL連接產物全部加入到100 μL感受態細胞中,輕輕混勻,冰浴30 min;

c.將EP管放在42 ℃熱水中熱激90 s,再放回冰上2-3 min;

d.在EP管中加入400 μL 預熱的LB培養基,置於搖床上,37 ℃、200 rpm培養1 h;

e.將轉化後的菌液離心後保留100 μL均勻塗至LB固體培養基上(氨苄黴素抗性,終濃度50 μg/mL),37 ℃恒溫培養箱先正置5 min,然後倒置培養過夜。

轉化後挑選陽性克隆質粒,經測序鑒定無誤後進行後續誘導表達實驗。


3.2提取質粒轉化BL21分子伴侶

1.將鑒定正確的表達重組質粒轉化BL21分子伴侶感受態細胞(和轉化DH5α同理)。

2.挑取單菌落接種至4 mL培養瓶中(含終濃度為50 μg/mL的氨苄黴素,50 μg/mL氯黴素),37 ℃,220 rpm培養過夜;

3.將過夜培養的菌液以1:100的比例接種於500 mL LB培養瓶中(含終濃度為50 μg/mL的氨苄黴素,50 μg/mL氯黴素)。待OD600=0.4-0.6時,將菌液放於4 ℃冰箱20 min,再放入15 ℃搖床靜置20 min,降溫;

4.吸出500 μL菌液作為未誘導對比 ,向剩餘菌液中加入終濃度為0.1 mM IPTG,未誘導的菌液與誘導的菌液,15 ℃,24 h培養。


3.3超聲破碎菌液

收集培養24 h後的菌液(10000 rpm,20 min,4℃),用PBS洗滌一遍,之後進行濃縮(濃縮比例約20:1),超聲破碎20 min,結束後4 ℃、12000 rpm、30 min離心分別收集上清和沉澱,將所作對照組進行同樣的處理。

取誘導前全菌,誘導後全菌,誘導後上清,誘導後沉澱等各40 μL,加入10 μL 5×loading buffer,煮沸10 min,冰浴2-3 min,進行SDS-PAGE電泳分析,確定表達產物是可溶性的存在於上清還是包涵體形式存在沉澱中。若是可溶性的之後則進行蛋白純化,若是包涵體則進行蛋白變複性。


IPTG誘導蛋白A表達結果:

IPTG誘導蛋白A表達結果圖 - 合肥知恩生物

A:蛋白A-pCold-BL21分子伴侶IPTG誘導前全菌

B:蛋白A-pCold-BL21分子伴侶IPTG誘導後全菌

C:蛋白A-pCold-BL21分子伴侶IPTG誘導後上清

D:蛋白A-pCold-BL21分子伴侶IPTG誘導後沉澱


蛋白純化步驟簡介:

a.按照樣品:鎳平衡液為1:3體積混勻;

b.吸取1 mL鎳柱,使用15-20 mL平衡液洗滌(含有20 mM咪唑);

c.上樣:將處理後的樣品加入鎳柱中,使其緩慢流下,約0.5 mL/min;

d.重複c步驟一次,流速可加快至1-2ml/min;

e.洗雜:使用15-20 mL  洗雜液(含有50 mM咪唑)洗雜;

f.洗脫:緩慢加入洗脫液(含有300 mM咪唑),慢慢收集流出的液體,分步收集,每500 μL收集一管,分別測定濃度。


最終純化後的蛋白,脫鹽後進行SDS-PAGE檢查,評價純化效果。


原核表達中常見問題及解決辦法

一、不知道蛋白的特性和結構

首先確定這些蛋白質是否有人研究過?還是最新發現的蛋白?如果沒有人研究過,那就先測部分氨基酸,然後設計引物克隆。如果有人研究過,那就可以根據軟件來預測。如果有swiss-pdb軟件,但這個是要有氨基酸序列,知道基因序列,可以再NCBI上進行blasts,得到蛋白。


二、表達菌株的選擇

原核係統和真核細胞偏愛的密碼子有不同,因此真核基因中的密碼子對原核係統來說可能是稀有密碼子,影響目的蛋白的表達,因此針對不同的問題選擇不同的表達宿主菌。

所遇問題
可能原因
嚐試宿主表達菌
蛋白不表
E.coli的密碼子偏移性
Rosetta2
Rosetta-gami2
Rosetta-gamiB
出現截斷蛋白
Rosetta Blue
蛋白表達不理想
蛋白降解
BL21(DE3)-Codon Plus(DE3)
蛋白表達為包涵體
Origami B(DE3)(不能具有卡那黴素抗性質粒的表達)  分子伴侶:ESL、KJE
二硫鍵錯誤折疊
Origami B(DE3)Shuffle T7(不能具有卡那黴素抗性質粒的表達)
過高本底表達
BL21(DE3)pLysS
蛋白無活性
蛋白錯誤折疊
Origami2
Rosetta-gami2
Rosetta-gamiB


三、質粒測序正確無法表達

如果稀有密碼子,如果比較多,可以嚐試rosetta(DE3)菌株,可能是基因本身的問題。這種情況的出現大多由於RNA3’的特殊結構導致,因此可以嚐試融合表達,譬如pET-32a。另一原因可能是蛋白表達量過低,western blot,定性的檢測後,即可得出結論。


四、如何提高重組蛋白表達在原核細胞裏的表達水平,特別是可溶性表達?

比較普遍的方法有基因優化,載體宿主優化篩選,表達條件優化,誘導條件優化等。降低重組蛋白合成的速率可溶性蛋白的產率取決於蛋白的合成速率,蛋白的折疊速率,以及聚集的速率。高水平表達時,肽鏈聚集的速率一旦超過折疊速率,就會形成包涵體。因此,降低重組蛋白合成的速率有利於提高重組蛋白的可溶性表達。


4.1密碼子優化

根據表達係統對密碼子的偏好性進行優化篩選,其目的是為了提高mRNA二級結構的穩定性,提高新生肽段的正確折疊,有助於外源活性蛋白的表達。


4.2表達溫度的選擇

大腸杆菌的最適生長溫度在37~39℃之間,但此溫度下極易生成包涵體蛋白,影響蛋白的可溶性表達,因此為了增加可溶蛋白的比例,低溫培養條件下表達外源蛋白是一個重要條件。


4.3誘導條件優化

搖瓶培養時,大多數會選擇低菌體濃度誘導,因為在低菌濃度下菌體處於對數生長期,生長活躍,有利於表達可溶性蛋白。然而,如果能保證合理的補料與充分的通氣,在較高菌濃度下誘導也同樣可能獲得可溶蛋白的高效表達。流加誘導劑在特定情況下也能顯著提高可溶蛋白的表達水平。


五、目的蛋白總是以不可溶的形式出現

在原核表達中目的蛋白經常發生錯誤的折疊,並聚集成為包涵體。經過誘導,目的蛋白通常可達細胞總蛋白的50%以上。雖然有一定比例的蛋白以可溶的單體形式存在,而多達95%(甚至更多)的蛋白則在包涵體中。實踐中,有很多實驗室采取降低誘導溫度,例如25–30 °C,或降低IPTG濃度(0.01–0.1 mM)並延長誘導時間,還有采用特別的培養基等方法獲得更多的可溶蛋白。然而,讓目的蛋白以包涵體形式聚集也並非總是壞事。


不溶態在某些情況下非常有利:

1.形成包涵體是目的蛋白表達量很高的表現。

2.作為初步分離,將目的蛋白的包涵體純化出來非常簡便。用核酸酶處理,並經簡單洗滌,通常可以獲得純度達75–95%的目的蛋白。

3.存在於包涵體中的目的蛋白通常可以免於蛋白酶的水解破壞作用。


研究者采用下述方法加強蛋白重折疊的效果,並在很多蛋白上取得了好結果,可以嚐試以下:當蛋白還結合在樹脂上時,使用6 M–8 M梯度鹽酸胍、1 mM還原性及0.2 mM氧化型穀胱甘肽處理,繼而用咪唑正常洗脫。有些實驗室在透析去除變性劑的過程中加入底物或類似物,也有幫助酶折疊的效果。


六、His標簽包在蛋白質結構內部還能用蛋白酶切除嗎?

重組蛋白純化標簽一般被包在內部,可以增加所提的蛋白質樣品的溶解度,適量增加變性試劑濃度或類型可以使得蛋白質的肽鏈鬆散開暴露出(組氨酸)6標簽。另外,還可以加大離子型、非離子型或兩性離子表麵活性劑的濃度或類型,加大DTT濃度(DTT濃度<1 mmol/L,否則DTT會與Ni2+結合),適當調整調高鹽濃度(氯化鈉溶液低於2mol/L,從低濃度到高濃度逐漸分梯度上升),因為His-6的親水性較強,增加可溶性之後His6容易暴露在水相,從而增加蛋白質的可溶性。加大DTT濃度也可以切斷二硫鍵使得蛋白質的肽鏈鬆散,進而使His-6容易暴露在水相,從而方便純化和酶切。如果以上條件都無法滿足實驗要求,建議不加His-tag,重新構建。


七、目的蛋白大於100 kd或含有多個亞基,是否可以用原核表達係統?

先例表明很多大蛋白已經在細菌中非常成功底表達了。多亞基複合物則可以通過分別表達各亞基,然後在有尿素的溶液中,將各組分以適當比例混和,再透析除去變性劑。


八、如果去除信號肽,會不會影響蛋白本身的表達?

重組蛋白表達強度不受信號肽調控,所以去除信號肽不會影響蛋白質表達。但是信號肽一方麵參與蛋白質折疊成特定空間結構,另一方麵其還決定蛋白最終被定位到特定的亞細胞區,一般蛋白隻有在特定亞細胞區才能發揮其功能,所以信號肽對蛋白最終活性還是有很大影響的。


九、E. coli會去除成熟蛋白N-端的甲硫氨酸嗎?這種加工對目的蛋白的穩定性有何影響?

N-端fMet是否被去除受倒數第二個氨基酸影響。這個加工過程由甲硫氨酸氨基肽酶催化,並受以下關係支配:去除的困難程度隨倒數第二位氨基酸的支鏈大小的增加而降低。研究者在實驗中發現以下氨基酸種類出現在倒數第二的位置上時,此加工過程極少發生或根本沒有發生:His、Gln、 Glu、Phe、Met、Ly、Tyr、Trp和Arg。而當倒數第二位上是其它種類的氨基酸時,加工過程發生的可能從16%到97%,Tobias等人 確定了在大腸杆菌中蛋白氨基末端氨基酸與其穩定性之間的關係,也即“N-端原則”。具他們報導:如果下列氨基酸位於氨基端時蛋白的半衰期僅為2分鍾:Arg、 Lys、Phe、Leu、Trp和Tyr。相反,其它氨基酸位於氨基端時可以使受檢蛋白的半衰期長達10小時以上。綜上兩條研究可以得出結論:Leu在氨基末端時很容易因為fMet被去除而暴露出來,從而導致蛋白的迅速水解。顯然,當采用pET載體上的 Nco I 或 Nde I位點表達非融合蛋白時,完全不必擔心Leu的密碼子出現在倒數第二的位置上。


十、如果目的蛋白包含信號序列,它會不會被運至細胞周質並以可溶、活性形式存在?抑或目的蛋白甚至可以被分泌到生長培養基中?

N-端如果帶有ompT 或 pelB 這樣的前導序列是使目的蛋白進入細胞周質的必要非充分條件。如果在生長培養基中發現目的蛋白的話,多半是因為細胞壁收到破壞,而並不代表蛋白是被分泌到培養基裏的。穿過大腸杆菌內膜的機製還不甚了了。已經清楚了蛋白的成熟區對轉運也有影響。雖然根據緊跟在信號肽序列後的目的蛋白序列可以對其輸出的可能作個大概判斷;但是由於蛋白的輸出效率依賴於目的蛋白的特性,還是不能僅僅根據其序列來預測輸出的實際情況。因此,實驗中,在細胞質中發現目的蛋白(仍然帶著未被切除的信號序列)或在細胞周質中有被部分加工的蛋白,在細胞周質及其它區域發現經過其它加工的蛋白,都不足為奇。某些情況下,降低誘導時的培養溫度至25–30 °C,可能提高輸出蛋白的比率。

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