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RNA提取實驗方法技巧分析

文字:[大][中][小] 手機頁麵二維碼 2019/2/12     瀏覽次數:    

通過總RNA提取可獲得高純度及高質量的總RNA,可滿足熒光定量PCR等生物學實驗需求。

本期主要來跟大家討論的話題是RNA的提取,想必大家心裏會有疑問,提取RNA這麽簡單的事情,按照試劑盒說明書操作不就可以了嗎?其實越簡單的東西遇到困難時就越難解,本篇主要介紹不同種類的樣本提取RNA時前處理的方式以及實驗中應該需要注意的事項,提取RNA時經常遇到的問題是 :

(1)RNA產量較低;

(2)RNA有嚴重的鹽類汙染;

(3)RNA有嚴重的有機溶劑汙染;

(4)樣品降解等問題,下麵就來一起探討下。

植物總RNA提取 - 合肥知恩生物


常用總RNA提取試劑

異硫氰酸胍法和Trizol法是動物組織及動物細胞總RNA提取最常用的方法,異硫氰酸胍法操作簡單快捷,適用於樣本足夠大的常規動物組織;Trizol法裂解能力較強,尤其適合小樣本及特別難提取的組織,如兔子皮膚,動物結締組織等總RNA的提取;另外Trizol作為一種通用型的裂解試劑,還可以用於植物組織、細菌、真菌等組織的提取。對於含多糖多酚的植物組織如油茶、茶葉、油菜等還可以使用CTAB法進行總RNA的提取。


動物組織總RNA提取

1、盡量選取新鮮的組織,如果不是新鮮的(最好在三個月之內-80℃冰箱或者在液氮中凍存的。在剪取組織時,不要拿到室溫直接剪取,一定要放到冰盒上,盡量避免反複凍融。

2、用幹淨的剪刀鑷子剪取一小塊組織,剪取樣本時盡量剪組織中央的部位,或者先將大塊的組織先從中間切開,然後再在新鮮切口的位置剪取樣本。取下的組織要充分的剪碎,將剪碎的組織放到無RNA酶的EP管中,加入裂解液,剪碎的組織要充分接觸裂解液,準備勻漿。

3、正常組織選取綠豆粒大小(30~60 mg)的組織進行勻漿,如果組織中含有大量的蛋白、脂肪或者是緊密的纖維組織比如肝髒等,適當增減剪取組織的量(可選10~20 mg)。

4、如果提取的是魚肌肉,蝦肉,海蜇等含水分較多的組織時則應當適當提高樣本量用量(推薦100~200 mg)。

5、條件允許的情況下,動物組織使用高通道組織勻漿機勻漿後即可直接進行提取步驟,如沒有該設備。

6、最後提取後得到的RNA一定要立即放到冰盒上,以減少RNA的降解。


動物細胞RNA提取

1、懸浮細胞:可直接離心後棄掉培養基,用無菌PBS清洗1~2遍後,再用適量PBS懸浮起來,然後再加入裂解液進行裂解。千萬不要完全棄掉液體後,往沉澱細胞裏直接加入裂解液,這樣會使外表層的細胞裂解後釋放的組蛋白包裹粘附在沉澱細胞外側,從而限製沉澱內部的細胞與裂解液的接觸,從而導致細胞裂解不徹底,降低RNA得率。

2、半貼壁或貼壁不緊的細胞:棄掉培養基後,用PBS洗1~2次,然後直接吸取適量PBS用吸管或者槍吹打培養皿,把細胞吹下來,轉移到無RNA酶的EP管中,加裂解液進行提取。

3、貼壁細胞:需要先用胰酶消化,然後收集到無RNA酶的EP管中,離心去其上清,用PBS洗1~2次,去除多餘的胰酶,以適量PBS重懸後繼續進行提取步驟。


植物RNA提取

植物組織中,富含酚類化合物,或富含多糖,或含有某些尚無法確定的次級代謝產物,或RNase的活性較高。這些物質在細胞裂解後與RNA緊密結合形成難溶複合物或者膠狀沉澱,很難將其去除。所以在提取植物組織時,要選取針對植物的試劑盒,試劑盒裏的裂解液能有效解決多酚易氧化、多糖化合物與核酸分離等難題。

1、植物的果皮、果肉、種子、葉片等要在研缽中充分研磨,研磨過程中液氮要及時補充,避免樣品融化,研磨後的樣品應迅速加入裂解液中震蕩混勻,避免RNA降解。

2、像水稻及小麥葉片等富含纖維的樣本,則應適當減少提取用量,否則組織研磨及裂解不徹底,會使提取的RNA產量較低。

3、含水分較多的植物組織例如石榴果實、西瓜果實、桃子果實等則應當適當提高樣本量(可選100~200 mg)。

4、植物組織,如植物葉片、根莖、堅硬的果實等材料一般建議使用液氮在研缽中徹底研缽成份,再繼續進行提取步驟。常規的組織勻漿機對植物組織的勻漿效果可能不佳,一般不建議使用。


RNA提取注意事項

1、組織樣本要盡可能的新鮮,避免反複凍融。

2、提取時組織要充分研磨,組織量不宜過少,更不宜過多。

3、加入裂解液後應給予充分的孵育時間,使樣本充分裂解。

4、在用Trizol法提取時,分層後吸取上清的原則是“寧願少吸,不能多吸”,千萬不能提取到中間層,否則會導致嚴重的基因組DNA汙染。

5、洗滌時洗滌液應充分浸潤到管壁的四周,確保洗滌徹底。

6、柱式提取法,洗滌完後除了對柱子進行空離後,還應當將吸附柱置於超淨台內吹風5~10 min,使有機溶劑充分揮發幹。

7、柱式法最後洗脫時候,當加入DEPC水後還應孵育3~5 min,或者提前將DEPC水加熱至60℃,可提高洗脫得率。傳統的Trizol裂解異丙醇沉澱法最後RNA是用DEPC水溶解沉澱,則應當給予適當溶解時間,並用槍頭不斷吹吸離心管底部。


RNA提取濃度不高或質量不佳原因及解決辦法

1、得率過低:提取樣本過低總量不足或者提取樣本過多裂解不徹底;應當使用適當質量的組織或細胞進行提取,樣本前處理一定要做好,裂解應充分。

2、基因組殘留:Trizol法提取時,分層後吸取上清時吸到中間層會帶來嚴重的基因組汙染;分層吸取時應當格外小心,不要吸取到中間層。如果是采用柱式法提取,可選擇含有DNase I的試劑盒進行提取,吸附在膜上的核酸直接用DNase I進行消化,可極大限度的降低DNA殘留。

3、RNA降解:可能是提取樣本本身降解,或者是在提取過程中導致的降級;應當盡可能使用新鮮樣本進行RNA提取,采集的樣本應當及時置於液氮或者-80℃冰箱凍存,並減少反複凍融。在RNA提取過程中應當使用RNase/DNase free的吸頭、離心管及其他材料,提取過程盡可能的快,提取後的RNA應置於冰盒上並及時放於-80凍存。如提取後的RNA需要進行凝膠電泳檢測,則應提取好後立刻進行電泳,電泳緩衝液應更換新配製的。

4、鹽及有機溶劑殘留:提取試劑中含有酚及胍鹽,洗滌液中含有乙醇,在提取過程中裂解液吸棄不徹底,洗液沒有充分晾幹導致的,殘留的鹽及有機溶劑對後續的逆轉錄和PCR均存在不同程度的抑製作用,因此在提取過程中應充分去除組織裂解液,洗滌時應充分,使管壁四周均能被洗滌到,另外管子空離和吹風是必須的步驟,會進一步降低有機物殘留。


以上內容就是不同樣本在RNA提取過程中的一些小技巧、注意事項及問題分析,希望能對你有所幫助。

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