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實驗技術交流

懸浮細胞株的穩定細胞株構建方法

文字:[大][中][小] 手機頁麵二維碼 2019/1/21     瀏覽次數:    

懸浮細胞穩定表達細胞株構建:慢病毒感染懸浮細胞一般比較難,且需要更高的MOI,所以構建懸浮細胞穩定表達細胞株需要注意一些細節。這一講主要從慢病毒如何感染懸浮細胞,感染後如何加壓篩選說起,然後對懸浮細胞穩定細胞株構建的主要流程及關鍵點分析。

注:穩定表達細胞株構建方法

慢病毒感染293T細胞 - 合肥知恩生物

慢病毒感染293T細胞


1
慢病毒感染懸浮細胞最佳複數MOI的確定

和第二講中介紹的方法相同,但病毒感染細胞的方法需要改進,簡要步驟如下:

(1)懸浮細胞吹散後計數,調整細胞密度至0.2-1×105/ml(具體接種數量需要參考細胞的大小和增殖速度);

(2)根據測定的慢病毒滴度,進行病毒的稀釋;

(3)MOI設定10、30、50、100;

(4)將稀釋後的細胞加入離心管進行離心去除上清,並加入稀釋後的病毒;

(5)混勻後將細胞接種於96孔板,同時加入終濃度為8µg/ml polybrene;

(6)將96孔板放入離心機,室溫低速(900-1500g)離心1h;

(7)再放入CO2培養箱繼續感染1h;

(8)根據細胞的生長狀態可以進行換液或補液;

(9)3天後觀察熒光比例判定最近MOI。


注意:

(1)細胞接種的密度,太稀有可能細胞會死亡,太密不利於後麵的熒光觀察,具體接種量要根據不同細胞的大小和增殖速度來確定;

(2)Polybrene的濃度選擇和貼壁細胞一樣,有部分細胞需要去摸索濃度;

(3)對於MOI的分組設置,一般懸浮細胞需要增加MOI值,可以根據文獻去適當調整;

(4)感染方式,常規方法是低速離心法,但有些實驗室沒有合適的離心機怎麽辦?可以選擇離心管靜置感染法,本實驗室也經常使用。可以將病毒稀釋液加入離心管混勻細胞後,直接將離心管放入CO2培養箱,靜置10-30min。再將病毒-細胞混合液吸入96孔板繼續感染1h。後麵方法相同進行換液或補液;

(5)感染體積的問題,本實驗常用的是1/2體積感染法,不管是離心法還是靜置法,感染的時候病毒液體積為培養體積的1/2。這樣能增加病毒的濃度,增加感染效果。後麵如果選擇補液的話,就可以直接補一半的培養基;

(6)換液和補液的選擇,本實驗室一般情況選擇補液,讓病毒持續感染。但如果病毒對細胞的生長有很大影響,則需要進行離心換液。


2
慢病毒感染目的細胞

(1)通過上述實驗確定了慢病毒感染目的細胞的最佳MOI,接下來就可以進行穩定細胞株的篩選工作了;

(2)將目的細胞計數後離心去上清,將稀釋後的病毒液混勻細胞後接種於24孔板,同時加入終濃度為8µg/ml polybrene。感染體積為終體積的1/2;

(3)將24孔板放入離心機,室溫低速(900-1500g)離心1h;

(4)再放入CO2培養箱繼續感染1h;

(5)補加1/2體積的培養基,CO2培養箱繼續培養。


注意:

(1)目的細胞的接種密度需要根據不同細胞進行調整;

(2)Polybrene的濃度根據不同細胞去調整;

(3)對於極難感染的細胞,可以進行重複感染,即第一次感染後48h再重新進行病毒感染。這樣可以增加病毒感染細胞的機率;

(4)如果病毒對細胞生長沒有太大影響的話,建議補液,讓病毒持續感染。


3
 加壓篩選(步驟和穩定表達細胞株構建相同)

(1)細胞感染病毒48h後,熒光顯微鏡下觀察熒光細胞比例;

(2)對24孔板細胞進行分孔,分成3-5個孔,過夜培養;

(3)根據包裝的慢病毒載體上的篩選抗生素,進行加壓篩選,這裏以嘌呤黴素為例;

(4)不同細胞對嘌呤黴素的敏感程度也不一樣,所以需要設濃度梯度。本實驗室的經驗是從1µg/ml到10µg/ml去設立3-5個濃度梯度;

(5)再培養24-48h後觀察細胞的死亡情況,選擇最佳的嘌呤黴素濃度孔細胞進行後續實驗;

(6)後期根據細胞的生長速度和生長情況,可以適當增大或減少嘌呤黴素的濃度;

(7)待細胞長滿後進行擴大培養,用於檢測目的基因的過表達或者幹擾情況;

(8)檢測正確後進行細胞的培養凍存。


注意:

(1)有些病毒感染懸浮細胞,熒光觀察時間會延長到72h或96h,並且熒光比較弱,需要耐心仔細觀察;

(2)可以先確定嘌呤黴素對目標細胞的最佳殺傷濃度,便於指導後麵的嘌呤黴素濃度梯度設定;

(3)懸浮細胞死亡後,剛開始不易觀察,需要耐心仔細觀察。換液時需要進行離心,如果細胞大量死亡,不易離心收集細胞可以進行不斷補液,待細胞長多後再進行離心換液;

(4)特別是感染效率低的情況下,熒光細胞也很少,這種情況會導致加嘌呤黴素後,幾乎活細胞就沒有幾個。出現這種情況,首先需要確定病毒包裝是否有問題,再者就是調整感染方法,可以進行多次持續感染;

(5)懸浮細胞的單克隆細胞株比較難,因為單個懸浮細胞不易生長,重點是不易觀察。如果需要構建單克隆的懸浮細胞株,方法可以參考上一講穩定表達細胞株構建中的稀釋方法。


知恩生物目前已經完成了多種穩定細胞株的構建,包括人、鼠、豬、犬等多物種,也包括懸浮細胞的穩定株,和lncRNA的穩定細胞株。同時構建了能分泌表達蛋白的穩定細胞株,為真核蛋白的大量表達帶來便利。

後期會不斷分享實驗過程中的一些小細節、小問題、小技巧等,歡迎大家一起來討論。

同時合肥知恩生物技術有限近期會推出慢病毒包裝試劑盒及穩定細胞株構建試劑盒,讓您在自己的實驗室中就能快速完成病毒的包裝。您隻需要構建好含目的基因的主質粒,其餘輔助質粒、轉染試劑、病毒濃縮液、感染增強劑、篩選細胞的抗生素等,全部為您提供。真正實現服務到家,一步完成病毒包裝和穩定細胞株的構建。

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