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穩定表達細胞株構建方法

文字:[大][中][小] 手機頁麵二維碼 2019/1/9     瀏覽次數:    

導讀

這一講,主要的目的是詳細講解一下利用慢病毒來構建穩定表達細胞株的主要流程,討論穩定株篩選過程中的關鍵點。讓初學者在完成慢病毒包裝後能夠快速的進行穩定表達細胞株的篩選與鑒定。


如果對慢病毒包裝還有疑問,請參考:慢病毒包裝要點解析。


穩定細胞株構建的主要流程及關鍵點分析:


1
最佳感染複數MOI的確定


眾所周知VSVG包膜蛋白能夠感染多數細胞,但是對於不同種屬、不同組織來源的細胞,慢病毒的感染性是有很大差別的。像一些神經細胞、淋巴細胞、樹突狀細胞等,慢病毒感染效率低。


MOI(multiplicity of infectin),感染複數,含義為感染時病毒和細胞數量的比值。比如細胞接種量為1×104/孔,MOI為10,慢病毒的滴度為1×108TU/ml,那麽每孔加入慢病毒的量為1µl。


那如何確定病毒感染目的細胞的MOI呢?多數細胞查閱文獻也能獲得推薦的MOI,但不同實驗室,不同病毒測算出的MOI也有差別。所以建議根據自己包裝的慢病毒重新檢測MOI。簡要步驟如下:


(1)目的細胞正常傳代,接種96孔板,按細胞的生長速度來確定接種量,一般情況以72h長滿單層為標準;


(2)根據測定的慢病毒滴度,進行病毒的稀釋;


(3)MOI設定1、5、10、20;


(4)96孔板中的細胞過夜培養後,換液加病毒,同時加入終濃度為8µg/ml polybrene;


(5)3天後觀察熒光比例;


(6)以80%細胞發熒光來評價最佳MOI。



注意:

(1)細胞接種的密度,太稀有可能細胞會死亡,太密不利於後麵的熒光觀察。96孔板大部分細胞可以接種1-5×103/孔,具體接種量要根據不同細胞的生長速度來確定;


(2)Polybrene的濃度也需要根據不同的細胞去調整,有些細胞比較敏感,可以不加;


(3)對於MOI的分組設置也需要根據不同細胞去調整,大部分癌細胞可以根據上麵的比例去設置,但有些難感染的細胞可能需要增加到100個MOI。




2
慢病毒感染目的細胞


通過上述實驗確定了慢病毒感染目的細胞的最佳MOI,接下來就可以進行穩定細胞株的篩選工作了。


將目的細胞接種24孔板,控製好細胞密度,貼壁後大約為30%-40%左右的密度;


細胞過夜培養後,按最佳MOI加入病毒,同時加入終濃度為8µg/ml polybrene。



注意:

(1)目的細胞的接種密度,以接種病毒後48h長成單層為標準;


(2)Polybrene的濃度根據不同細胞去調整;


(3)用24孔板來進行實驗,主要是為了節約病毒的使用量。也可以直接拿上一步96孔板中的細胞進行後續實驗;


(4)對於極難感染的細胞,比如淋巴細胞之類的,需要進行特殊方法感染,後期會有相應專題來講解。




3
加壓篩選


(1)細胞感染病毒48h 後,熒光顯微鏡下觀察熒光細胞比例;


(2)對24孔板細胞進行傳代,根據細胞生長速度由一個孔分成3-5個孔,過夜培養。同時也接種正常的未感染病毒的目的細胞;


(3)根據包裝的慢病毒載體上的篩選抗生素,進行加壓篩選,這裏以嘌呤黴素為例;


(4)不同細胞對嘌呤黴素的敏感程度也不一樣,所以需要設濃度梯度。本實驗室的經驗是從1µg/ml到10µg/ml去設立3-5個濃度梯度;


(5)再培養24-48h後觀察細胞的死亡情況,選擇最佳的嘌呤黴素濃度孔細胞進行後續實驗;


(6)後期根據細胞的生長速度和生長情況,可以適當增大或減少嘌呤黴素的濃度;


(7)待細胞長滿後進行擴大培養,用於檢測目的基因的過表達或者幹擾情況;


(8)檢測正確後進行細胞的培養凍存或者繼續進行單克隆細胞株的篩選。


注意:

(1)嘌呤黴素最佳濃度的確定:首先是正常細胞必須全部死亡,其次就是根據各孔細胞死亡情況來確定,一般選擇死亡超過50%,細胞生長速度較其它孔不會明顯降低。因為細胞死亡少的話可能會有很多低表達量的細胞存在,如果細胞死亡過多,也會導致細胞擴增很慢,不利於快速獲得穩定細胞株;


(2)嘌呤黴素的濃度設置,可以去參考文獻,根據文獻推薦的濃度來進行梯度設置,如果沒有文獻支持,可以多設置梯度去篩選;


(3)選擇了最佳的嘌呤黴素濃度,不代表後麵一直用這個濃度,要根據細胞的生長情況來判斷,適時的去增減嘌呤黴素的濃度;


(4)細胞長滿後盡快擴大培養去檢測目的基因的表達情況,檢測方法一般是qPCR和WB;


(5)可以根據實驗目的選擇是否要進行單克隆細胞株的篩選。


4
單克隆細胞株的篩選


如何獲得高表達或者高幹擾效率的單克隆細胞株,是很多科研工作者比較頭疼的事情,往往單克隆細胞株的過表達或幹擾效率比混合克隆差。


在這裏,作者想說混合克隆和單克隆各有優缺點。混合克隆製備周期短,過表達和幹擾效果往往也很好,但隨著傳代次數的增加,過表達和幹擾效果可能會下降;單克隆細胞株傳代方麵會比混合克隆好,但其製備周期長,檢測成本也翻很多倍。因為如果想要獲得一株高表達或者高幹擾的穩定株,需要篩選很多單克隆細胞去進行檢測,工作量會增大很多倍。


所以如果想獲得效果好的單克隆細胞株,建議是增加篩選的總量。很多研究者正是因為篩選總量不夠,或者的單克隆細胞株數量有限,也就導致了很難篩到效果好的細胞株。


常規的篩選單克隆細胞株有兩種方法,原理是一樣的,操作上有些區別。


(1)有限稀釋法:將鑒定正確的混合克隆細胞株進行傳達計數,然後將細胞稀釋到每10ml 50個細胞。再將細胞懸液接種96孔板,一般情況建議接種4塊,便於後續篩選到效果好的單克隆細胞株;


(2)第二種方法原理一樣,操作是:A1孔接種1000個細胞,縱向往下倍比稀釋,然後所有的第一列細胞再橫向倍比稀釋。同樣建議接種4塊96孔板。



兩種方法都需要培養數天,並且需要不斷觀察,找出隻有單個細胞增殖的,且100%發熒光的細胞孔。做好標記,定期換液(含有嘌呤黴素)。


待細胞長滿後進行檢測,篩選出高表達或高幹擾效率的細胞株,然後進行擴大培養凍存或者進行後續實驗。



注意:

(1)由於第一種方法細胞接種量少,所以可以選擇一個孔多加些細胞,這樣觀察時方便用這個孔來進行聚焦;


(2)接種96孔板時,可以不用加嘌呤黴素,待細胞生長穩定後再換液,補加嘌呤黴素;


(3)增大篩選的總量,是為了能獲得最佳效果的單克隆穩定細胞株。




5
案例圖片展示

SUNE過表達細胞穩定株▼SUNE過表達細胞穩定株


293T過表達穩定細胞株

▼293T過表達細胞穩定株


乳腺癌細胞過表達穩定株

 ▼乳腺癌細胞過表達穩定株


乳腺癌細胞幹擾穩定株

▼乳腺癌細胞幹擾穩定株


molt4懸浮細胞幹擾穩定株

▼molt4懸浮細胞幹擾穩定株


THP1懸浮細胞過表達穩定株

▼THP1懸浮細胞過表達穩定株


知恩生物目前已經完成了多種穩定表達細胞株的構建,包括人、鼠、豬、犬等多物種,也包括懸浮細胞的穩定株,和lncRNA的穩定細胞株。同時構建了能分泌表達蛋白的穩定細胞株,為真核蛋白的大量表達帶來便利。



下一講:重點來討論一下慢病毒如何感染懸浮細胞,如何構建懸浮細胞的穩定株。


合肥知恩生物可為您提供專業的穩定表達細胞株構建、慢病毒包裝、熒光定量pcr、免疫組化等生物學實驗外包或醫學實驗外包服務,同時合肥知恩生物近期會推出慢病毒包裝試劑盒及穩定表達細胞株構建試劑盒,讓您在自己的實驗室中就能快速完成病毒的包裝。您隻需要構建好含目的基因的主質粒,其餘輔助質粒、轉染試劑、病毒濃縮液、感染增強劑、篩選細胞的抗生素等,全部為您提供。真正實現服務到家,一步完成慢病毒包裝和穩定表達細胞株的構建。


技術問題谘詢QQ:397675441  曹老師

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