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實驗技術交流

慢病毒包裝原理、流程、步驟、方法總結

文字:[大][中][小] 手機頁麵二維碼 2018/12/18     瀏覽次數:    

導讀

這一講,主要的目的是梳理一下慢病毒包裝的主要流程,討論包裝過程中的關鍵點。讓初學者能毫無障礙地自主完成病毒包裝、純化、滴度測定等實驗。

病毒包裝的主要流程及關鍵點分析,以293T細胞為例:


慢病毒感染293T細胞 - 合肥知恩生物

▼慢病毒感染293T細胞





1
293T細胞分盤

轉染前一天,將已經長好的細胞以合適的比例傳代到10cm培養皿中,當細胞長到80%時準備轉染,步驟如下:

1)棄去培養液,加入5 mL 滅菌PBS溶液,輕輕晃動,洗滌細胞生長麵,然後棄去 PBS 溶液。
2)用2 mL 胰蛋白酶消化對數生長期的293T細胞。

3)以含10%血清的培養基調整細胞密度為5 ×106個/10 mL,重新接種於10cm細胞培養皿中,37 ℃,5% CO2 培養箱繼續培養,轉染前細胞密度80%左右。


 注意:293T細胞的狀態非常重要,一般建議購買新的細胞株後分批多次凍存,以保證每次包裝病毒時細胞的代數不會超過10代。同時盡量不要使用國產血清。複蘇後的細胞需要傳2代後才能進行病毒的包裝,並且傳達後18-24h需要密度達到80%左右。




2
 轉染前換液

轉染前1~2h 將需要轉染的細胞換新鮮的培養基,8mL/10cm皿。

注意:293T細胞貼壁性不是很好,換液時應小心滴加盡量避免衝起細胞。




3
轉染

(1)以一個10cm平皿為例,取2個EP管,分別加入500 µl生理鹽水,標記為A、B;

(2)A管加入60µg PEI,並充分渦旋混勻,B管加入過表達質粒和兩個輔助質粒pSPAX2、pMD2.G,三質粒比例為4:3:1,共24µg;

(3)將A管PEI加入到B管中,輕輕混勻,靜置20min;將混合液加入細胞中,過夜培養。


   注意:質粒提取的質量,包括濃度和純度。濃度至少要超過500ng/ul,因為濃度低,加入的體積就會相應增大,會增加細胞汙染的風險。純度可以使用核酸測定儀進行檢測,260/280在1.8-2.0之間。有條件的可以選擇去內毒素試劑盒進行提取,會對病毒的產量有幫助。同時,由於輔助質粒使用頻率高,可以選擇進行大提,分裝低溫保存,保證後續包病毒質粒的穩定性。




4
換液

轉染過夜後,小心吸掉細胞培養液棄於盛有消毒液的廢液杯中,然後加10mL新鮮的細胞培養基繼續培養。


注意:此時棄去的培養基中已含有少量的病毒,必須經處理後才能丟棄,所用的移液槍頭等必須經消毒液浸泡至少15min後才能丟棄。

加入的新鮮培養基一般選擇FBS濃度為2%-5%,可以根據細胞的生長狀態來選擇。




5
病毒收集

換液後48h,收集細胞上清液於50mL離心管,4度保存。並根據細胞生長狀況適當補充新鮮細胞培養基(含2%-5% FBS的DMEM)。

24h後再次收集細胞上清液於同一個50mL離心管。4℃,4500g離心20min,上清液用0.45μm濾器過濾後轉移到新的離心管。過濾後的細胞上清液如果暫時不進行進一步處理,請及時於-80℃儲存。


注意:細胞轉染後24h就可以看到熒光蛋白的表達,48h可以進行熒光照片的采集,判斷轉染效率。一般為了能獲得高滴度的病毒,需要通過不斷優化條件,提高轉染效率。優化條件包括:三質粒的比例優化,轉染試劑的優化,細胞培養條件的優化等。




6
慢病毒的濃縮與純化

病毒過濾後需進行濃縮,采用PEG8000方法濃縮病毒;

(1)5X PEG8000 —NaCl配製:稱取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q純水中;121攝氏度 30min 濕熱滅菌 30min;保存在4℃;
(2)每30ml過濾後的病毒初始液,加入5X PEG-8000 —NaCl母液7.5 ml;
(3)每20~30min混合一次,共進行3-5次;
(4)4度放置過夜;
(5)4度,4000 g,離心 20min;
(6)吸棄上清,靜置管子1~2分鍾,吸走殘餘液體;
(7)加入適量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉澱;
(8)溶解後的病毒懸液分裝成小份,保存於-80 ℃,避免反複凍融。


注意:試劑盡量選擇sigma,同時需要保證配置的準確性。離心後可以直接看到病毒沉澱,吸走液體時要小心,不要吸走了沉澱。溶解時如果發現很難吹打,可以適當的靜置一會再去吹打混勻。病毒溶解後需要及時分裝保存,避免使用時反複凍融。




7
病毒滴度的測定

(1)將生長狀態良好的293T細胞消化計數後稀釋至1×105/ml,加入96孔板,100μl/孔。放入37℃,5%CO2培養箱中培養;

(2)在EP管中做10倍梯度稀釋,連續10個稀釋度。稀釋方法如下:每種病毒準備10個1.5ml EP管,每管加入900μl培養液,往第一個管中加入100μl病毒原液,混勻後,吸取100μl加入第二個管混勻。依此類推,做十個稀釋度,每個稀釋度做4個重複孔;

(3)吸取96孔板中原有的培養基,加入稀釋好的病毒液100μl;

(4)兩天後在每個孔再加入100μl完全培養液,利於細胞的生長;

(5)第五天在熒光顯微鏡下觀察結果,並數出最後兩個有熒光的熒光細胞克隆數。假設為X和Y,則滴度(TU/ml)=(X+Y*10)*1000/2/X孔的病毒液的含量(μl)。


注意:濃縮後的病毒可以適當將起始稀釋度增大,避免病毒的浪費。條件允許的情況下可以每個稀釋度多做些重複,保證實驗結果的可靠性。病毒滴度是在293T細胞上測定的,不代表其感染其它細胞的能力。所以當病毒感染其它細胞時,需要多做幾個MOI的梯度,以確保感染效果的最佳化。




8
案例圖片展示

慢病毒感染sune.png

▼慢病毒感染SUNE細胞


下一講:重點討論穩定細胞株構建過程中的關鍵點,讓新手們能快速掌握。


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